【摘要】 本发明公开了属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域的一种多环芳烃好氧降解纯 菌种的分离纯化方法与应用。超净工作台中制作以多环芳烃为唯一碳源和能源的琼脂固体培 养基底层平板，在底层平板上制作含有多环芳烃好氧降解菌群的琼脂固体培养基顶层平板， 将制作好的培养基平板在培养箱中培养10～15天。在在超净工作台中向加入多环芳烃、基础培 养基、微量金属液、维生素c溶液及吸附剂的锥形瓶内接入培养基平板中的菌落，在温度为 25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养5～7天。然后进行循环转接，在循环次数大于8次后 即可得到能够好氧降解多环芳烃的纯菌种。本方法能够分离纯化得到对多环芳烃好氧降解性 能好的微生物纯菌种。 ： 【专利类型】发明申请 【申请人】北京师范大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】100875北京市海淀区新街口外大街19号 【申请人地区】中国 【申请人城市】北京市 【申请人区县】海淀区 【申请号】CN200810147112.4 【申请日】2008-08-19 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101654656A 【公开公告日】2010-02-24 【公开公告年份】2010 【授权公告号】CN101654656B 【授权公告日】2012-01-04 【授权公告年份】2012.0 【发明人】豆俊峰; 丁爱中 【主权项内容】1.一种多环芳烃好氧降解纯菌种的分离纯化方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下： (1)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL 维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为：NH4Cl：1.5g·L-1， KH2PO4：1.5g·L-1，MgCl2：0.25g·L-1，CaCl2·2H2O：0.10g·L-1；微量金属液的组成为： CoCl2·6H2O：50mg·L-1，CuCl2：0.30mg·L-1，H3BO3：10.0mg·L-1，MnCl2·4H2O：40mg·L-1， Na2MoO4·2H2O：5.0mg·L-1，NiCl2·2H2O：2.5mg·L-1，ZnCl2：3.5mg·L-1 id="icf0001" file="A2008101471120002C1.tif" wi="1" he="5" top= "70" left = "149" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/> (2)向体积为150mL的锥形瓶内加入50mL按步骤(1)配制的液体培养基和0.60g琼脂， 然后在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至65～70℃时，在超净工作台中将 其倒入体积为160mL的培养皿中，为除去培养基表面多余的水分将该培养皿在超净工作台中 放置2天 id="icf0002" file="A2008101471120002C2.tif" wi="3" he="3" top= "103" left = "33" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/> (3)在超净工作台中向步骤(2)中的培养皿中加入0.5mL浓度为1g/L的多环芳烃丙酮 溶液，来回倾斜转动培养皿使多环芳烃的丙酮溶液均匀分布，为除去培养基表面的丙酮将该 培养皿在超净工作台中放置2天 id="icf0003" file="A2008101471120002C3.tif" wi="2" he="3" top= "127" left = "76" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/> (4)向体积为25mL的锥形瓶内加入10mL按步骤(1)配制的液体培养基和0.25g琼脂， 在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在超净工作台中冷却至38～40℃ id="icf0004" file="A2008101471120002C4.tif" wi="2" he="4" top= "144" left = "151" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/> (5)在超净工作台中向步骤(4)的锥形瓶中加入1mL通过富集与驯化筛选得到的多环 芳烃好氧降解菌群溶液，摇匀后吸取1mL慢慢加入步骤(3)中的培养皿中，来回倾斜转动培 养皿使接种有混合菌群的培养基溶液均匀分布。将培养皿放入温度为25℃的培养箱中培养观 察，10～15天后便可发现有明显的菌落出现 id="icf0005" file="A2008101471120002C5.tif" wi="3" he="5" top= "177" left = "98" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/> (6)在超净工作台中向体积为25mL的锥形瓶中加入4.0mL浓度为1g/L的多环芳烃 丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天 id="icf0006" file="A2008101471120002C6.tif" wi="5" he="3" top= "193" left = "104" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/> (7)按水与高分子树脂吸附剂的质量比为5∶1的比例用去离子水将吸附剂清洗5次，然 后按乙醇与吸附剂的质量比为3∶1的比例用99％的乙醇将吸附剂清洗3次，为彻底除去吸附 剂中的乙醇将清洗后的吸附剂在超净工作台中放置2天 id="icf0007" file="A2008101471120002C7.tif" wi="4" he="3" top= "218" left = "121" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/> (8)向步骤(6)中的锥形瓶内加入10mL按步骤(1)配制的液体培养基，然后加入经 步骤(7)处理后的吸附剂0.15g，将其密封后放置在转速为100r/min的振荡器中平衡2天 id="icf0008" file="A2008101471120002C8.tif" wi="2" he="3" top= "235" left = "187" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/> (9)在超净工作台中挑取步骤(5)培养皿中的菌落，将其接种至步骤(8)中的锥形瓶 中，在温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养5～7天 id="icf0009" file="A2008101471120002C9.tif" wi="4" he="3" top= "251" left = "134" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/> (10)将步骤(2)至步骤(9)作为一个分离纯化周期；重复步骤(2)至步骤(9)， 但每次用前一个分离纯化周期中步骤(9)的菌液代替步骤(5)中用到的多环芳烃好氧降解 菌群溶液。分离纯化8个周期以上即可得到能够高效好氧降解多环芳烃的纯菌种。 【当前权利人】北京师范大学 【当前专利权人地址】北京市海淀区新街口外大街19号 【统一社会信用代码】12100000400010056C 【被引证次数】TRUE 【家族被引证次数】TRUE
