【摘要】 一种利用SAMPL技术进行不结球白菜分子标记的方法，包括DNA提取、DNA酶切-连接体系的优化、SAMPL预扩增体系的优化、SAMPL扩增体系的优化、电泳、银染显色和聚类分析，其中：对DNA样品使用EcoRI、MseI或PstI酶中进行酶切，并用T4-DNA连接酶把相对应的EcoRI、MseI或PstI的接头连接上去；采用10μL反应体系进行SAMPL预扩增；预扩引物是与酶切中所选择的酶所对应的引物；采用20μL反应体系进行SAMPL扩增，扩增引物一个是与预扩增引物相对应的引物，另一个为SAMPL引物。本发明对SAMPL的复杂体系进行优化和引物设计，构建了适用于不结球白菜的SAMPL反应体系，实现不结球白菜分子标记。 【专利类型】发明授权 【申请人】上海交通大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】200240 上海市闵行区东川路800号 【申请人地区】中国 【申请人城市】上海市 【申请人区县】闵行区 【申请号】CN200810036842.7 【申请日】2008-04-29 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101260433B 【公开公告日】2010-11-17 【公开公告年份】2010 【授权公告号】CN101260433B 【授权公告日】2010-11-17 【授权公告年份】2010.0 【IPC分类号】C12Q1/68 【发明人】陈火英; 王新华; 刘杨 【主权项内容】一种利用SAMPL技术进行不结球白菜分子标记的方法，其特征在于，包括步骤如下：①DNA提取，②DNA酶切-连接体系的优化，③SAMPL预扩增体系的优化，④SAMPL扩增体系的优化、电泳、银染显色，⑤聚类分析；其中：所述DNA酶切-连接体系的优化，具体为：对DNA样品使用EcoRI、MseI或PstI酶中的一种进行酶切，并用T4-DNA连接酶把相对应的EcoRI、MseI或PstI的接头连接上去，采用26μL反应体系，分成两步：第一，13.5μL酶切反应体系包括2-5U的酶和50-250ng的DNA，在37℃水浴3-8小时；第二，连接反应体系包括13.5μL酶切液、1-4pmol的EcoRI接头或PstI接头或者10-40pmol的MseI接头、0.2-1U的T4-DNA连接酶、2-8μmol的ATP，在室温下过夜，产物稀释一倍，-20℃保存备用；所述SAMPL预扩增体系的优化，具体为：采用10μL反应体系进行SAMPL预扩增，其中1-5mmol·L-1 MgCl2，0.1-0.5mmol·L-1dNTPs，10-80ng的预扩引物，0.1-1U Taq聚合酶，0.2-2μL酶切连接产物；预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；PCR扩增程序采用94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒，共24个循环，最后72℃延伸30分钟；预扩引物为一个，是与酶切中所选择的酶所对应的引物，其序列为：E00 5′-GACTGCGTACCAATTC-3′M00 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′P00 5′-GACTGCGTACATGCAG-3′；所述SAMPL扩增体系的优化，具体为：采用20μL反应体系进行SAMPL扩增：1-5mmol·L-1 MgCl2，0.1-0.5mmol·L-1 dNTPs，30-150ng的引物，0.2-2U Taq聚合酶，2-6μL预扩增产物；所述SAMPL扩增体系的优化，其中扩增引物包括：E1S1、E2S1、E3S2、P1S1、M1S3和E4S4，其中：E15′-GACTGCGTACCAATTCAAG-3′；E25′-GACTGCGTACCAATTCACT-3′；E35′-GACTGCGTACCAATTCAGG-3′；E45′-GACTGCGTACCAATTCAAC-3′；S15′-GTGTTAGGGAGCTGGAGAAT-3′；S25′-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3′；S35′-ACACACACACACACATATAA-3′S45′-TCGTTGGTCGGTCACTCCTT-3′；P15′-GACTGCGTACATGCAGTA-3′；M15′-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3′；PCR扩增程序采用94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，65-56℃复性30秒，每个循环降低0.7℃，72℃延伸60秒，共12个循环；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒，共24个循环，最后72℃延伸30分钟；选择扩增引物有两个，一个是与预扩增引物相对应的引物，在E00、M00或P00序列后增加1-3个碱基，另一个引物为SAMPL引物；所述聚类分析，具体为：在电泳图谱上同一SAMPL位点上有电泳带记录为1，无电泳带记录为0，作0，1矩阵图输入计算机，采用DPS或NTSYS-PC数据处理系统，根据UPGMA构建聚类树状图，或则采用MapMaker软件构建遗传图谱或特定基因定位图谱。 【当前权利人】上海交通大学 【当前专利权人地址】上海市闵行区东川路800号 【统一社会信用代码】1210000042500615X0 【引证次数】1.0 【他引次数】1.0 【家族引证次数】1.0 【家族被引证次数】6
