【摘要】 一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白表面展示系统的构建，属于生物技术领 域，其特征是：基因的获得，(1)PCR扩增，(2)SlpA基因与pMD18-T Vector系统连接，(3)克隆质粒pMD18T-S的鉴定。构建，(1)目的 基因和双标记表达载体的获得，(2)双标记表达载体与SlpA的连接 转化，(3)表面展示载体系统鉴定，(4)S-层蛋白在重组体表面锚定 表达情况检测。其有益效果是：1.所构建的载体可以用于转化入 S-层蛋白基因缺陷的乳酸菌内来研究乳酸菌S-层蛋白形成的机制。 2.利用DNA重组技术，将病原体的保护性抗原基因与该表面展示载 体上的乳酸菌S-层蛋白相融合。 【专利类型】发明申请 【申请人】长春理工大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】130022吉林省长春市卫星路7989号 【申请人地区】中国 【申请人城市】长春市 【申请人区县】朝阳区 【申请号】CN200810051044.1 【申请日】2008-08-01 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101638660A 【公开公告日】2010-02-03 【公开公告年份】2010 【发明人】王春凤; 李景梅; 刘琼; 田坚 【主权项内容】1、一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白表面展示系统的构建，其特征是： a、嗜酸乳杆菌S-层蛋白SlpA基因的获得 (1)SlpA基因的PCR扩增 将复苏的嗜酸乳杆菌菌种采用染色体提取试剂盒，按说明书操作提取染色体DNA；根据 已发表S-层基因的序列，设计了一对引物，在引物的5’端和3’分别加有酶Sac I 和Kpn I酶切位点；用Ex Taq DNA聚合酶以染色体DNA为模板进行PCR扩增目的基因； 引物的设计：根据已发表的S-层蛋白基因序列设计引物； P1：5’GGC GAGCTCATGAAGAAAAATTT 3’ Sac I P2：5’GTGGGTACCTTATCTAAAGTTTG 3’ KpnI (2)SlpA基因与pMD18-T Vector系统连接 将回收产物与载体初步定量，设计连接反应体系，在0.5mL离心管中加入PCR纯化产 物4μL，pMD18-T Vector 1μL，Ligation Mix 5μL，混匀，16℃连接2h后，转化 大肠杆菌JM109感受态细胞； (3)克隆质粒pMD18T-S的鉴定 将转化后的细胞取100-200μl菌液涂布于准备好的LB-AMP琼脂平板(含200μg/ml AMP，20 ％X-gal和40mmol/L IPTG)37℃培养过夜；蓝白斑筛选出转化子，酶切及PCR鉴定后，送至 TAKARA公司测序，序列测定后应用DNAStar软件进行分析，将阳性转化子命名为pMD18T-S； b、表面展示系统pW425et-S的构建 (1)目的基因SlpA和双标记表达载体pW425et的获得 将双标记表达载体pW425et和克隆质粒pMD18T-S质粒用SacI和KpnI限制性内切酶进 行酶切，以获取粘末端的pW425et载体及SlpA基因片段；酶切完毕后，进行1％琼脂糖凝胶 电泳，用维特洁回收纯化试剂盒回收纯化，以用于下一步连接； (2)双标记表达载体pW425et与SlpA的连接转化 将回收纯化后具有粘末端的SlpA基因及pW425et载体片段，按照一定的比例加入到0.5 mL离心管混匀后，同时设空载体对照组(所加SlpA片段用双蒸水替代)，经T4DNA Ligase 在16℃连接2h，4℃过夜；将连接产物10μL转化到100μL感受态细胞X13中，同时 向另100μL感受态细胞中加入10μL灭菌双蒸水，作为阴性对照，加入5μL没有进行 酶切的pW425et质粒作为阳性对照，吸取150μL培养物涂布于LB-EM(EM：200μg/ml) 平板，37℃过夜培养； (3)表面展示载体系统pW425et-S鉴定 提取转化成功的细菌质粒，分别用SacI和KpnI进行酶切鉴定，PCR鉴定，筛选出阳性 重组子； (4)S-层蛋白在重组体E.coli X13S8表面锚定表达情况检测 (a)pW425et-S表达产物的SDS-PAGE分析 挑取转化成功的单菌落，分别接种于10mL LB-EM培养液，37℃振摇过夜，取5mL过夜 培养物接种于100mL LB-Em培养液，37℃200r/min振摇培养使其OD600在0.6～0.8之间。添 加40mM DL-苏氨酸，继续培养，加入之前取菌一次，之后每2h取一次菌液，至第10h，最 后统一调OD600值至0.68，样品处理好后，取上清15μL按进行12％凝胶SDS-PAGE分析； (b)表达S-层蛋白的Western blotting分析 表达产物经SDS-PAGE后，以BIO-RAD系统电转移至PVDF膜上，经牛血清白蛋白封闭后， 依次加入乳杆菌S-层蛋白多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，最后在联苯胺 (DAB)溶液中显色，并观察结果； (c)用全细胞ELISA检测S-层蛋白在大肠杆菌的表面锚定情况 将大肠杆菌X13空载体和重组菌X13S8诱导8h的细胞，再用PBS按梯度稀释到OD600分别为 0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，进行全细胞ELISA检测S-层蛋白在大肠杆菌的表面锚定情 况； (d)免疫荧光检测 收集经诱导后培养8h的重组菌大肠杆菌X13S8，PBS洗涤，用2％的甲醛固定于载玻片， 以大肠杆菌X13为对照，在载玻片上滴加稀释的鼠抗S-层蛋白抗体，然后加入用异硫氰酸荧 光素标记的兔抗鼠IgG血清(1∶100)，包埋载玻片，用荧光显微镜进行检测。 【当前权利人】长春理工大学 【当前专利权人地址】吉林省长春市卫星路7989号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12220000412756090P 【被引证次数】TRUE 【家族被引证次数】TRUE
