【摘要】 本发明公开了鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原的一种提取、纯化方法。该方法采用玻璃珠处理和饱和硫酸铵沉淀与分子筛过滤相结合的方案，成功地从鼠疫耶尔森氏菌的培养物中提取、纯化出高纯度的天然F1抗原。经免疫学检测和动物保护实验证明，用本发明方法获得的天然F1抗原具有较高的免疫保护作用和检测灵敏度，如以相同浓度的本发明天然F1抗原和经表达获得的重组F1抗原(rF1)，分别对同一小鼠腹水样本进行F1单克隆抗体检测，结果显示，天然F1抗原检测的抗体滴度明显高于重组rF1抗原的检测结果。本发明将在鼠疫亚单位疫苗的研制及鼠疫的检测诊断(如免疫学检测等)中发挥重要作用，应用前景广阔。 【专利类型】发明授权 【申请人】中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】100071 北京市丰台区东大街20号 【申请人地区】中国 【申请人城市】北京市 【申请人区县】丰台区 【申请号】CN200810055697.7 【申请日】2008-01-07 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101220086B 【公开公告日】2010-08-25 【公开公告年份】2010 【授权公告号】CN101220086B 【授权公告日】2010-08-25 【授权公告年份】2010.0 【IPC分类号】C07K14/24; A61K39/02; A61P31/04; G01N33/569; G01N33/53 【发明人】王效义; 王棠; 朱紫雯; 祁芝珍; 吴本传; 郭兆彪; 杨永海; 崔百忠; 王祖陨; 王虎; 杨瑞馥 【主权项内容】鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原的提取、纯化方法，是先从鼠疫耶尔森氏菌培养物中分离培养上清和菌体沉淀，再利用饱和硫酸铵沉淀从培养上清中以及利用玻璃珠从菌体沉淀中分别提取出多部分鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原粗蛋白，再将各部分鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原粗蛋白各自通过饱和硫酸铵沉淀、凝胶过滤得到多部分纯化的鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原；包括以下获取第一部分至第四部分任意一种鼠疫耶尔森氏菌天然F1目标抗原的必要步骤：1)鼠疫耶尔森氏菌的培养：将鼠疫耶尔森氏菌接种到添加质量/体积百分浓度为0.1-0.3％木糖的心脑浸液培养基中，在35-40℃下培养12-96h；2)对步骤1)得到的鼠疫耶尔森氏菌培养物进行离心，分离出培养上清和菌体沉淀；3)鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原粗蛋白的提取：将步骤2)分离出的上清用30-50％饱和硫酸铵沉淀，再离心，分离出上清和沉淀，弃掉上清，得到A部分粗蛋白；将步骤2)分离出的菌体沉淀用PBS缓冲液重悬后，加入玻璃珠，在35-40℃、100-400rpm下振摇12-24h，再离心，分离出用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清和用于提取D部分粗蛋白的菌体沉淀；将用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清用30-50％饱和硫酸铵沉淀，再离心，弃掉上清，将沉淀用0.005-0.015M的PB缓冲液重新溶解后，再用20-30％饱和硫酸铵沉淀，离心，分离出含B部分粗蛋白的上清和含C部分粗蛋白的沉淀；将用于提取D部分粗蛋白的菌体沉淀重悬于0.005-0.015M的PBS缓冲液中，超声，离心，弃掉沉淀，将上清用30-50％饱和硫酸铵沉淀，再离心，分离出上清和沉淀，弃掉上清，得到D部分粗蛋白；4)将步骤3)获得的A部分粗蛋白溶于0.005-0.015M的PBS缓冲液中后，用20-30％饱和硫酸铵沉淀，离心，弃掉沉淀，将上清再用1-10％饱和硫酸铵沉淀，离心，弃掉上清，将沉淀溶于0.005-0.015M的PBS缓冲液中，过Sephacryl S-200HR凝胶柱，洗脱液为pH 7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl缓冲液，透析，得到第一部分天然F1抗原纯化蛋白；5)将步骤3)获得的含B部分粗蛋白的上清用1-10％饱和硫酸铵沉淀，离心，弃掉上清，将沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，过Sephacryl S-200HR凝胶柱，洗脱液为pH 7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl缓冲液，透析，得到第二部分天然F1抗原纯化蛋白；6)将步骤3)获得的含C部分粗蛋白的沉淀溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，再用20-30％饱和硫酸铵沉淀，离心，弃掉沉淀，将上清用1-10％饱和硫酸铵沉淀，离心，弃掉上清，将沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，过Sephacryl S-200HR凝胶柱，洗脱液为pH 7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl缓冲液，透析，得到第三部分天然F1抗原纯化蛋白；7)将步骤3)获得的D部分粗蛋白溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，用20-30％饱和硫酸铵沉淀，离心，弃掉沉淀，将上清用1-10％饱和硫酸铵沉淀，盐析，离心，弃掉上清，将沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，过Sephacryl S-200HR凝胶柱，洗脱液为pH 7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl缓冲液，透析，得到第四部分天然F1抗原纯化蛋白；第一至第四部分天然F1抗原纯化蛋白中的一种或它们之间任意几种组合的混合产物构成所要的鼠疫耶尔森氏菌天然F1目标抗原。 【当前权利人】中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 【当前专利权人地址】北京市丰台区东大街20号 【被引证次数】3 【被他引次数】3.0 【家族被引证次数】6
