【摘要】 一种鸡防御素-1基因真核表达质粒及其使用方法，其特征在于由 pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸡防御 素-1基因片段构成，将鸡防御素-1基因真核表达质粒用PBS缓冲液稀释 到1mg/ml，就成为鸡防御素-1基因分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-1。本发 明与已有技术相比，具有鸡防御素-1所特有的免疫增强效果的、适合与 鸡DNA疫苗一起使用的优点。 【专利类型】发明申请 【申请人】佛山科学技术学院 【申请人类型】学校 【申请人地址】528000广东省佛山市禅城区江湾一路十八号 【申请人地区】中国 【申请人城市】佛山市 【申请人区县】禅城区 【申请号】CN200810219775.2 【申请日】2008-12-08 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101629182A 【公开公告日】2010-01-20 【公开公告年份】2010 【授权公告号】CN101629182B 【授权公告日】2011-09-07 【授权公告年份】2011.0 【发明人】张辉华; 杨小梅; 马保华; 谢青梅; 马静云; 曹永长; 毕英佐 【主权项内容】1、一种鸡防御素-1基因真核表达质粒，其特征在于由pcDNA3.1(+) 真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸡防御素-1基因片 段构成，该鸡防御素-1基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引 物、下游引物的设置过程；2、鸡防御素-1基因片段的PCR获取过程；3、 鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程；4、鸡防 御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程； (1)、上游引物、下游引物的设置过程：引物的设计及合成是根据国内 外已在GenBank中登录的鸡防御素-1基因序列经多重比较后设计，并在 5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，上 游引物设计去掉了前导肽处开始，并加上Hind III酶切位点；下游引物 设计在基因末端，并加上BamH I酶切位点，所需要的引物序列为： 上游引物：5’-CGAAGCTTAAACCATGGGAAGGAAGTCAGATTG-3’ 下游引物：5’-TTGGATCCTCAGCCCCATATTCTTTTGC-3’ (2)、鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程：以重组质粒pGEM-T-Gal-1 为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增 反应，PCR的反应体系为：5μL的10×PCR buffer，2μL的4×dNTPs， 0.5μL的浓度为20μmol/L的上游引物，0.5μL的浓度为20μmol/L的 下游引物，1μL的pGEM-T-Gal-1质粒，40.5μL的ddH2O，0.5μL的浓 度为5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶，反应过程是：a、混合物先在95℃处 理3min；b、然后在94℃处理45s，再在55℃处理45s，再在72℃处理 1min；反应过程b循环30次；然后在72℃处理10min，重组质粒 pGEM-T-Gal-1于华南农业大学动物科学学院家禽研究室所克隆并保 存的重组质粒pGEM-T-Gal-1；所获得的鸡防御素-1基因片段核苷酸序列 为： ATGGGAAGGAAGTCAGATTGTTTTCGAAAGAGTGGCTTCTGTGCATTTCTGAAGTGCCCTTCC CTCACTCTCATCAGTGGGAAATGCTCAAGATTTTACCTCTGCTGCAAAAGAATATGGGGCTGA ； PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，见到约130bp的扩增条带， 表明已扩增到目标产物； (3)、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程： 将过程2的鸡防御素-1基因片段的PCR扩增产物用氛氯仿抽提纯化，加 入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解，TE溶解物用BamH I、Hind III进行双酶切处理，胶回收约130bp左右的条带；以同样的方法对 pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb左右的DNA片断，分别 取5μL双酶切后胶回收的鸡防御素-1基因片段和3μL双酶切后胶回收 的pcDNA3.1(+)质粒，加入1μL的10×T4 DNA连接Buffer，1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化DH5α感受态 细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养18小时；pcDNA3.1(+)质 粒为Invitrogen公司的产品 a、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的双酶切鉴定： 在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨 苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA 进行双酶切鉴定；将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1 分别用BamH I、Hind III进行双酶切，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳 观察，pcDNA3.1(+)-Gal-1双酶切后产生约5.4kb和130bp左右的两条带， 证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1； b、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的PCR鉴定： 在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青 霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行 PCR鉴定；以质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、 上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：5μL的10×PCR Buffer，2μL的4×dNTPs，浓度均为20μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，pGEM-T-gal-1质粒1μL，ddH2O 40.5μL，浓度为5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5μL；反应过程为：a、95℃处理3min；b、然后94℃45s、 55℃45s、72℃1min；反应过程b循环30次，然后72℃延伸10min， PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，可见约130bp的扩增条带，证明已 经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1； (4)、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程： 从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml液 体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三 角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37℃，以200rpm/min 速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶 中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸡防 御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1。 【当前权利人】佛山科学技术学院 【当前专利权人地址】广东省佛山市禅城区江湾一路十八号 【统一社会信用代码】1244060045607389XC 【被引证次数】3 【家族被引证次数】3
