【摘要】 本发明涉及一种基于松材线虫携带的荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法。首先在体外培养松材线虫携带的荧光假单胞菌菌株GcM5-1A(保藏编号为CCTCC No：M204065)，从该菌株发酵液中分离纯化鞭毛蛋白，以此为抗原，免疫家兔制备兔抗鞭毛蛋白的抗血清；然后用十二烷基硫酸钠溶液分别提取健康黑松和感染松材线虫病的黑松组织的全蛋白，将少量的提取液点样于聚偏氟乙烯膜上，用兔抗鞭毛蛋白的抗血清制备的按照Western blot的方法检测黑松的组织蛋白，感染松材线虫的黑松中提取的蛋白样品呈阳性，健康黑松组织的提取物呈阴性。该方法检测速度快，检测成本低，适合大规模的松材线虫病的调查，是对现有松材线虫病检测方法的有益补充。 【专利类型】发明授权 【申请人】青岛大学; 赵博光 【申请人类型】个人,学校 【申请人地址】266071 山东省青岛市市南区宁夏路308号 【申请人地区】中国 【申请人城市】青岛市 【申请人区县】市南区 【申请号】CN200810013913.1 【申请日】2008-01-09 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101334363B 【公开公告日】2010-04-14 【公开公告年份】2010 【授权公告号】CN101334363B 【授权公告日】2010-04-14 【授权公告年份】2010.0 【IPC分类号】G01N21/78; G01N21/64; C12Q1/04 【发明人】李荣贵; 郭道森; 赵博光 【主权项内容】1.一种基于荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，取斜面培养的保藏编号为CCTCC No：M 204065的荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的菌苔两环接种子LB液体培养基中，30℃培养24小时，转接于大容量LB培养基中，同样条件下继续培养24小时；将细菌培养液离心，取上清进行硫酸铵分级沉淀，取20％饱和度的沉淀用TE溶液溶解，对TE溶液透析过夜后，用超滤浓缩管浓缩，取浓缩液上Superdex-75凝胶过滤柱进行分子筛层析，洗脱液为TE溶液，分步收集，各步用SDS-PAGE分析检测，合并含50kD蛋白的洗脱液；将该洗脱液上DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析，用含0-1000mM NaCl的TE缓冲溶液洗脱，分步收集，SDS-PAGE检测，得到了电泳纯的蛋白，合并含50kD蛋白的洗脱液，对蒸馏水透析过夜，得到纯化的分子量为50kD的荧光假单胞菌鞭毛蛋白；第二步，将荧光假单胞菌鞭毛蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫接种雄性日本家兔，三周后用鞭毛蛋白加强免疫一次，十天后，静脉取血，离心，获得兔抗鞭毛蛋白的抗血清；第三步，分别取感染松材线虫病的黑松组织和健康黑松组织，粉碎，加入0.5％～1.0％十二烷基硫酸钠溶液，50～80℃浸提20～30min，离心，取少量上清点在聚偏氟乙烯膜上，5分钟后，1～25℃将聚偏氟乙烯膜浸在封闭液中30分钟，按照1∶1000的体积比加入兔抗鞭毛蛋白的抗血清，混匀，25℃温育30分钟，用20mM，pH7.5的Tris-Cl洗膜3次，加入封闭液，并按照1∶2000的体积比加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，25℃温育30分钟，用20mM，pH7.5的Tris-Cl洗膜3次，最后将聚偏氟乙烯膜浸于显色缓冲液中显色，自来水冲洗终止反应，于感染松材线虫病的样品呈现褐色斑点，健康黑松组织的样品不显色。 【当前权利人】青岛大学; 赵博光 【当前专利权人地址】山东省青岛市市南区宁夏路308号; 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12370000495571728M 【引证次数】3.0 【他引次数】3.0 【家族引证次数】3.0 【家族被引证次数】3
