【摘要】 本发明公开了一种将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，步骤包括构建的含有外源基因的质粒提取及质粒浓度校正，喜温硫杆菌感受态细胞的培养和收集，电转化，平板筛选，阳性转化子鉴定和检测；其中：所述电转化参数为：电压10, 500V/cm；电阻400Ω；电容：25μF。本发明首次实现了喜温硫杆菌的电转化，并确立了喜温硫杆菌复苏培养方案及筛选方法；为喜温硫杆菌的基因工程育种、遗传学及分子生物学研究提供了方便、快速和高效的基因导入方法。 【专利类型】发明授权 【申请人】山东大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】250061 山东省济南市历下区经十路73号 【申请人地区】中国 【申请人城市】济南市 【申请人区县】历下区 【申请号】CN200810140399.8 【申请日】2008-10-17 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101372695B 【公开公告日】2010-08-18 【公开公告年份】2010 【授权公告号】CN101372695B 【授权公告日】2010-08-18 【授权公告年份】2010.0 【IPC分类号】C12N15/74; C12N1/20 【发明人】林建群; 陈林旭; 李兵; 林建强 【主权项内容】一种将构建的含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，步骤包括构建的含有外源基因的质粒提取及质粒浓度校正，喜温硫杆菌感受态细胞的培养和收集，电转化，平板筛选，阳性转化子鉴定和检测；其特征在于：所述提取获得的质粒浓度应不小于70ng/μL；所述喜温硫杆菌感受态细胞的培养和收集的方法是：菌种于Starky-S0液体培养基中，100～150r/min，35～39℃振荡培养4～7天至指数生长后期，12, 000r/min，10min，4℃离心收集细胞；无机盐洗涤液重悬细胞，2, 000r/min，5min，4℃离心除去细胞悬液中Starky-S0培养基带入的硫粉；取上清，5, 000r/min，5min，4℃收集细胞；再以由5, 000r/min向3, 000r/min离心转速逐级降低的方式并用渗透压逐渐降低的清洗液重复清洗细胞，制备电转化感受态细胞；所述电转化参数为：电压10, 500V/cm；电阻400Ω；电容：25μF；电转化中质粒与菌体混合的体积比为：1∶40～55，其中感受态细胞悬液的OD600值是1.0；所述平板筛选是将电转后的菌悬液加入到Starky-S0液体培养基中，39℃，60r/min培养24小时后加入链霉素使其终浓度达200μg/ml，然后提高转速至120r/min，再培养24小时后，进行平板筛选；所述阳性转化子鉴定采用PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测实现；上述喜温硫杆菌是喜温硫杆菌MTH-04，保藏编号为CGMCC NO.1742；上述无机盐洗涤液配方：(NH4)2SO4：0.6g；KH2PO4：0.6g；MgSO4·7H2O：0.1g；CaCl2·2H2O：0.05g；加蒸馏水至200mL，自然pH，15磅/cm2，灭菌20min。 【当前权利人】山东大学 【当前专利权人地址】山东省济南市历下区经十路73号 【统一社会信用代码】12100000495570303U 【家族被引证次数】3
