【摘要】 本发明公开一种分离提取糜蛋白酶的方法，包括：将牛胰腺粉碎、过滤，提取滤液；对滤液去除杂蛋白，精制浓缩；加入硫酸铵并用氢氧化钠调pH值进行培养使糜蛋白酶原析出结晶；对上述培养物进行抽滤，提取出糜蛋白酶原，培养物抽滤液回收待用，加入胰蛋白酶使其酶解激活，经过滤后得第一半成品溶液；用CM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用乙酸缓冲液进行平衡，平衡后用培养物抽滤液上样，用平衡液洗柱，洗至流出液OD 280值小于0.1，换用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为第二半成品；合并第一半成品和第二半成品，脱盐浓缩，除菌过滤，冷冻真空干燥，即得糜蛋白酶成品。本发明解决了亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少的缺点，适用于规模化大生产。 【专利类型】发明授权 【申请人】北京格源天润生物技术有限公司 【申请人类型】企业 【申请人地址】102609 北京市大兴区生物医药产业基地天府路3号 【申请人地区】中国 【申请人城市】北京市 【申请人区县】大兴区 【申请号】CN200810115987.6 【申请日】2008-07-01 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101302505B 【公开公告日】2010-12-08 【公开公告年份】2010 【授权公告号】CN101302505B 【授权公告日】2010-12-08 【授权公告年份】2010.0 【IPC分类号】C12N9/64 【发明人】吕向广 【主权项内容】一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1)将牛胰腺粉碎、过滤，提取滤液；2)取压滤液通过40KD中空纤维超滤柱去除杂蛋白，超滤液再通过10KD中空纤维超滤柱进一步精制浓缩；3)将精制浓缩液加入硫酸铵，并用氢氧化钠调节PH值进行培养使糜蛋白酶原析出结晶；4)对得到的培养物进行抽滤，所得滤饼即为糜蛋白酶原，抽滤液回收待用；将糜蛋白酶原用4倍纯化水溶解，完全溶解后按每公斤滤饼加入10ml体积的比例加入0.25mol/L的磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠缓冲液，用NaOH调整PH到7.6，按每升溶液加入4～12mg，3000u/mg以上的高比活胰蛋白酶，于2～8℃条件下酶解，每隔20分钟监测溶液活性，当糜蛋白酶活性达到1500u/mg时用HCl调PH值为3～3.5，溶液回复稳定状态，即终止激活，将溶液在0.5～2kg负压条件下用布氏漏斗减压、抽滤，滤饼弃之，溶液即为第一半成品；5)用CM‑sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用0.02mol/L乙酸缓冲液进行平衡，平衡后用上一步培养物抽滤液直接上样，用上述平衡液洗柱，洗至流出液OD280值小于0.1，换用0.02mol/L磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠缓冲液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为第二半成品；6)合并第一半成品和第二半成品，用5KD中空纤维超滤器脱盐浓缩，用0.22μm除菌滤器除菌过滤，冷冻真空干燥，即得糜蛋白酶成品。。 【当前权利人】北京格源天润生物技术有限公司 【当前专利权人地址】北京市大兴区生物医药产业基地天府路3号 【专利权人类型】有限责任公司 【统一社会信用代码】91110115668439232L 【引证次数】2.0 【他引次数】2.0 【家族引证次数】2.0 【家族被引证次数】8
