【摘要】 一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，属于蓝藻分离纯化技术领域。本发明利用冻溶和低离子强度溶涨快速提取异藻蓝蛋白，经硫酸铵分级沉淀、羟基磷灰石吸附富集异藻蓝蛋白，并通过羟基磷灰石层析大量制备得到较纯的异藻蓝蛋白，最后利用离子交换层析技术，得到高纯度的异藻蓝蛋白。本方法省去了传统的应用分子筛层析结合羟基磷灰石层析共三步层析的复杂分离纯化程序，克服了难于规模化快速大量制备的难题，大大降低了APC的制备成本，从而为将APC应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础。 【专利类型】发明授权 【申请人】山东大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】250100 山东省济南市历下区山大南路27号 【申请人地区】中国 【申请人城市】济南市 【申请人区县】历下区 【申请号】CN200810014405.5 【申请日】2008-02-28 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101240011B 【公开公告日】2010-08-11 【公开公告年份】2010 【授权公告号】CN101240011B 【授权公告日】2010-08-11 【授权公告年份】2010.0 【IPC分类号】C07K1/14; C07K1/30; C07K1/18 【发明人】张玉忠; 苏海楠; 解彬彬; 陈秀兰; 张熙颖; 周百成 【主权项内容】一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，步骤如下：(1)异藻蓝蛋白的提取将螺旋藻用冻溶和低离子强度溶涨的方法解体溶解，离心分离，取上清液，即得异藻蓝蛋白浆液；步骤如下：将螺旋藻藻体加入pH6.8～7.0的0.02mol/L磷酸缓冲液，在-20℃下冷冻，然后在20～25℃下，融化2～3h；反复冻融2-4次后，螺旋藻悬液在4℃下，8000rpm～10000rpm离心10min～15min，上清液即为异藻蓝蛋白浆液；(2)异藻蓝蛋白的初步纯化用硫酸铵沉淀法，将异藻蓝蛋白从异藻蓝蛋白浆液中沉淀出来，离心收集沉淀，再用pH6.8～7.0的20mM磷酸缓冲液，溶解并透析，除去硫酸铵，得异藻蓝蛋白粗提液；步骤如下：向异藻蓝蛋白浆液中加入固体硫酸铵，至浓度为30％，为重量体积比，放置4～5h，然后在4℃下，10000rpm～11000rpm离心10min～15min，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵，至最终浓度为60％，为重量体积比，放置4h以上，然后在4℃下，10000rpm～11000rpm离心10min～15min，弃上清，取沉淀；将沉淀溶于pH6.8～7.0的20mM的磷酸缓冲液中，然后用pH6.8～7.0的20mM的磷酸缓冲液进行透析，收集透析液，即得异藻蓝蛋白粗提液；(3)羟基磷灰石层析提取异藻蓝蛋白使用羟基磷灰石在异藻蓝蛋白粗提液中吸附富集异藻蓝蛋白，然后用磷酸缓冲液进行洗脱，得异藻蓝蛋白溶液；步骤如下：将预先用pH6.8～7.0的20mM磷酸缓冲液平衡过的羟基磷灰石，加入异藻蓝蛋白粗提液中，将吸附满异藻蓝蛋白的羟基磷灰石从溶液中取出，使用pH6.8～7.0的20mM磷酸缓冲液冲洗羟基磷灰石，将羟基磷灰石上残余的C-藻蓝蛋白冲洗掉，再用pH6.8～7.0的100mM磷酸缓冲液进行洗脱，将异藻蓝蛋白洗脱下来，即得异藻蓝蛋白溶液；(4)离子交换制备高纯度异藻蓝蛋白取步骤(3)制得的异藻蓝蛋白溶液，在pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液中透析，然后取透析后的溶液，在经pH5.0、含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸缓冲液预先平衡的、规格为0.6×10cm的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱上，用pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液洗脱，再用pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液和pH3.6、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液各100mL进行梯度洗脱，洗脱速度为60～70mL/h，检测波长280nm，收集洗脱的蓝液体，得到纯化的异藻蓝蛋白。 【当前权利人】山东大学 【当前专利权人地址】山东省济南市历下区山大南路27号 【统一社会信用代码】12100000495570303U 【引证次数】2.0 【他引次数】2.0 【家族引证次数】2.0 【家族被引证次数】4
