【摘要】 基因克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因插入到能够自主复制的DNA载体上，从而引入到寄主细胞中进行增殖的操作。。微信 【专利类型】发明申请 【申请人】李祥 【申请人类型】个人 【申请人地址】271000 山东省泰安市泰山区金山路61号 【申请人地区】中国 【申请人城市】泰安市 【申请人区县】泰山区 【申请号】CN200810238571.3 【申请日】2008-12-19 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101760462A 【公开公告日】2010-06-30 【公开公告年份】2010 【IPC分类号】C12N15/29; C12N15/10 【发明人】李祥 【主权项内容】1.常用的植物基因克隆技术 1)转座子标签技术 转座子标签技术是将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部或附近，基因发生突变而被标识然后利用插入DNA片段做探针克隆到该基因，利用转座子标签技术克隆到的有玉米的Hm1基因，蕃茄的Cf-9基因，烟草的N基因和亚麻的L6基因，玉米中的可转移因子如Ac/Ds，Spm及Mu为克隆植物中未知结构和功能的抗病基因带来了一线希望，但是由于太高的突变率而使R基因的克隆受到阻滞，如玉米的Rp1， 2)图位克隆技术 图位克隆技术是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，目标基因精确定位在染色体特定位置之后，用目标基因两侧紧密连锁的标记筛选含有大的插入片段的基因组文库(如BAC和YAC)，通过染色体步行(Chromosome Walking)筛选到含有目标基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。其核心技术是染色体步行，如果能找到与目标基因很近的标记，以至于二者之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小，就可以直接筛选到含有目标基因的克隆，最终得到候选基因，这种策略称为染色体登陆(Chromosome Landing)(Tanksley et al，1995)， 3)同源克隆法 同源克隆法的理论基础是，几乎所有的基因之间都彼此相关。人们将功能相似，相同始祖的基因归为一个家族，基因家族的成员往往成簇存在，几个基因家族组成一个超基因家族，超基因家族各成员之间既有高度同源区域，也有高度趋异区。首先根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物，然后用简并引物对含有目的基因的DNA文库进行PCR扩增，再对PCR扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。 4)差异表达基因的克隆 生物体的生长发育以及衰老过程是遗传信息有序地时空表达的结果，因而分离差异表达基因将是认识生命活动过程的切入点。分离差异表达基因的有三种方法：差异筛选(differentialscreening)、扣除杂交(subtraction hybridization)和差异显示反转录PCR(differential displayreverse transcription PCR，DDRT-PCR)，前两种方法因缺点较多，应用较少，DDRT-PCR技术在实际应用较多。DDRT-PCR技术利用真核生物成熟mRNA具有3′-Poly(A)结构，用Oligo-dTMN(M＝ACG，N＝AGCT)作为锚定引物与mRNA的Poly(A)结合，在反转录酶的作用下将mRNA反转录为cDNA，然后以原Oligo-dTMN和10bp随机引物组成的引物对在不同的cDNA中进行PCR扩增。把用相同引物对在不同cDNA中获得的PCR扩增产物并排在聚丙烯酰胺测序胶上电泳分离，由于扩增的cDNA片段被放射性同位素或荧光素标记，通过自显影或显色，即可获得差异表达基因扩增的条带。将差异表达的cDNA条带回收、克隆后，作为探针通过Northern杂交验证，即可用于全长基因的分离。该技术具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高，可同时比较多种生理状态细胞内mRNA样品等优点。 5)表达序列标签法 表达序列标签是完整基因上能够特异性标记基因的一部分序列，通常包含了基因足够的结构信息区，从而与其它基因相区分。基本过程为：对已知的部分序列进行数据库分析，筛选出代表新基因的EST及相应的重叠群、定位信息等，根据所得信息设计引物，制备探针；用探针进行cDNA文库筛选，得cDNA阳性克隆，接着用所设计的引物与所得cDNA阳性克隆载体臂进行巢式PCR和5’、3’-RACE，得5’端和、3’端部分序列；对所得阳性克隆和末端序列进行测序；通过数据库对新序列进行分析；若第一步有新EST的定位信息，即可对基因进行定位和结构分析，若无定位信息，还要筛选基因组文库，进行测序和荧光原位杂交(FISH)定位等工作；最后对新发现的基因进行突变检测和表达分析。 【当前权利人】李祥 【当前专利权人地址】山东省泰安市泰山区金山路61号 【被引证次数】9 【被他引次数】9.0 【家族被引证次数】9
