【摘要】 本发明公开了一种超氧化物歧化酶基因食品级表达方法及其专用载体。该方法是构建含有超氧化物歧化酶基因的酿酒酵母食品级表达载体，将构建的酿酒酵母食品级表达载体导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母，诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。本发明能直接表达出食品级的超氧化物歧化酶产物，弥补了传统SOD制备方法以及毕赤酵母和原核表达系统表达方式的表达产物需经复杂步骤纯化后才能用于食品生产中的不足；本发明还具有原料生物体生长周期短，生产规模大，提取成本低的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。 【专利类型】发明授权 【申请人】中山大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】510275 广东省广州市新港西路135号 【申请人地区】中国 【申请人城市】广州市 【申请人区县】海珠区 【申请号】CN200810025998.5 【申请日】2008-01-24 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101255436B 【公开公告日】2010-12-01 【公开公告年份】2010 【授权公告号】CN101255436B 【授权公告日】2010-12-01 【授权公告年份】2010.0 【IPC分类号】C12N15/53; C12N15/81; C12N9/08 【发明人】朱倩婷; 赵士炜; 黄晓峰; 张文庆 【主权项内容】一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法，其特征在于包括如下步骤：首先，超氧化物歧化酶基因插入酿酒酵母表达载体的多克隆位点处后，构建含有超氧化物歧化酶基因的酿酒酵母表达载体，通过限制性内切酶Nco I和ApaL I双酶切该表达载体，完全去除AmpicillinR抗生素筛选标志，同时切去了URA3基因片段的部分片段；然后，将被酶切去除的URA3片段重新与含有超氧化物歧化酶基因的酿酒酵母表达载体连接，得到含有超氧化物歧化酶基因、GAL1启动子和终止子序列、多克隆位点、URA3片段以及不含有AmpicillinR抗生素筛选标志的食品级酿酒酵母表达载体即食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体；将改造好的酿酒酵母食品级表达载体导入酿酒酵母中，筛选获得重组酿酒酵母，诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达，具体包括如下步骤：(1)将中国拟青霉Cu，Zn‑SOD即psSOD基因mRNA全长序列，进行全基因合成，所述psSOD基因mRNA全长序列如下：Atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaattttgagcaggagtccgattcctcgcccaccaccatctcctgggagatctctaaccacgatgccgacgccaagcgtggcttccacatcacaccctttggtgacaataccaacggctgcacctctgctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaaccgacacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccataaaggacaagctcatcaagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcattcacgccggcactgatgacctaggcaagggtggcaacgacgagtcactcaagaccggcaatgctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaactaa；(2)设计并合成一对基因特异引物：pYESpsSODf正向引物和pYESpsSODr反向引物，其序列为如下：pYESpsSODf：5’‑ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC‑3’；pYESpsSODr：5’‑ACCTCTAGATTAGTTGGCGACGCCAATG‑3’；以步骤(1)得到的含psSOD基因片段的质粒为模板，pYESpsSOD(f+r)为引物，进行PCR扩增psSOD，并使克隆的psSOD两端分别加上了Hind III和Xba I酶切位点；得到的基因片段psSOD与pMD18‑T载体连接，命名为pMD18‑T‑psSOD质粒，经测序与上述mRNA全长序列相符；(3)用限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切酿酒酵母表达载体pYES2/CT及上述pMD18‑T‑psSOD质粒，分别得到双酶切载体与目的基因纯化液；将回收纯化的双酶切载体与目的基因纯化液以T4DNA连接酶进行连接，得到的重组载体命名为pYES‑psSOD；(4)根据酿酒酵母表达载体pYES2/CT载体的序列，设计上下游引物ura2和ura3，以扩增载体2823～3513bp之间片段，并在片段的一端即载体第2823bp端引入ApaL I酶切位点：所述ura2：5’‑GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT‑3’；所述ura3：5’‑GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC‑3’；以酿酒酵母表达载体pYES2/CT质粒为模板，ura2、ura3为引物进行PCR扩增，回收目的片段URA3后，将目的片段URA3与pMD18‑T连接，重组质粒命名为pMD18‑T‑ura，所述URA3片段序列如下：Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctatactgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccgggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacccatgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg；(5)将已经构建好的酿酒酵母重组表达载体pYES‑psSOD及pMD18‑T‑ura重组质粒，用ApaL I和Nco I进行双酶切，分别回收纯化pYES‑psSOD的5103bp大片段及pMD18‑T‑ura的700bp片段；将回收纯化的双酶切pYES‑psSOD载体的5103bp大片段与pMD18‑T‑ura的700bp片段以T4DNA连接酶连接，重组质粒命名为pYES‑psSOD‑F，即为食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体；(6)将上述的食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体pYES‑psSOD‑F导入酿酒酵母中，筛选获得重组酿酒酵母，诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。 【当前权利人】中山大学 【当前专利权人地址】广东省广州市新港西路135号 【统一社会信用代码】121000004558631445 【引证次数】3.0 【他引次数】3.0 【家族引证次数】3.0 【家族被引证次数】1
